可熒光定量活細(xì)胞的脂肪酸β-氧化活性試劑

可熒光定量活細(xì)胞的脂肪酸β-氧化（FAO）活性的試劑

FAOBlue

FAOBlue是一款可以通過(guò)藍(lán)色熒光可視化脂肪酸分解的共同途徑——脂肪酸β-氧化（FAO）的活性的試劑。

通過(guò)熒光成像，可以簡(jiǎn)單地檢測(cè)出過(guò)去難以檢測(cè)的活細(xì)胞中的脂肪酸β-氧化活性。

該產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用于對(duì)比評(píng)估不同細(xì)胞種類之間的β-氧化，探索促進(jìn)或抑制β-氧化活性的化合物，β-氧化相關(guān)酶群的基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域。

※　本產(chǎn)品基于九州大學(xué)研究生院藥學(xué)研究院藥物發(fā)現(xiàn)化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域 王子田彰夫教授的研究成果，

※　由Funakoshi株式會(huì)社商品化并銷售。

※　本產(chǎn)品僅供研究使用。

使用FAOBlue可視化HepG2細(xì)胞的FAO活性

添加FAOBlue到HepG2細(xì)胞中，觀察活細(xì)胞成像，可從細(xì)胞中觀察到藍(lán)色熒光。另一方面，若使用FAO抑制劑進(jìn)行前處理，則熒光強(qiáng)度明顯減少，由此可知，藍(lán)色熒光的強(qiáng)度取決于FAO的活性。

◆何為脂肪酸β-氧化（Fatty acid beta-oxidation; FAO）

脂肪酸是構(gòu)成細(xì)胞的各種脂質(zhì)的基本要素，與葡萄糖、氨基酸并稱為能源。尤其是在葡萄糖不足而饑餓的時(shí)候，脂肪酸會(huì)分解活躍，產(chǎn)生大量的ATP。雖然脂肪酸根據(jù)碳鏈的長(zhǎng)短以及不飽和度的差別而存在不同的種類，但是由于它的分解屬于線粒體等細(xì)胞器的共同分解途徑，因此這種途徑被統(tǒng)稱為脂肪酸β-氧化（Fatty acid beta-oxidation; FAO）。

脂肪酸β-氧化主要通過(guò)4步酶反應(yīng)——1）脂肪酸β位的氧化，2）β位的水合，3）β位的氧化，4）裂解，被階段性分解為2個(gè)碳原子的短鏈脂肪酸和作為ATP原料的乙酰CoA。其中生成的2個(gè)碳原子的短鏈脂肪酸再通過(guò)同一個(gè)循環(huán)，以2ⁿ個(gè)碳原子的短鏈脂肪酸重復(fù)分解。

研究提出，癌癥以及非酒精性肝炎（NASH）等疾病中，脂肪酸β-氧化會(huì)出現(xiàn)很大的變動(dòng)，因此開發(fā)檢測(cè)脂肪酸β-氧化活性的方法備受期待。然而，在活細(xì)胞中檢測(cè)多種酶參與的脂肪酸β-氧化一直以來(lái)都十分困難。

FAOBlue是一款新型脂肪酸β-氧化應(yīng)答型熒光探針，由九州大學(xué)研究生院藥學(xué)研究院、專攻藥物發(fā)現(xiàn)化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的王子田彰夫教授開發(fā)。只需將產(chǎn)品添加到培養(yǎng)基中的簡(jiǎn)單操作，便可以通過(guò)熒光觀察定量脂肪酸β-氧化活性。

◆原理

FAOBlue是一種在碳原子數(shù)為9的壬酸的碳鏈末端添加了藍(lán)色熒光色素xiangdousu衍生物的化合物，此外，通過(guò)用乙酰氧基甲基酯保護(hù)末端脂肪酸來(lái)提高細(xì)胞膜透過(guò)性。雖然FAOBlue中含有xiangdousu衍生物，但是在該狀態(tài)下，它不會(huì)在405 nm激發(fā)下發(fā)出熒光。

1. 附著在羧基的乙酰氧甲基具有高疏水性，因此FAOBlue可以跨越細(xì)胞膜，有效地?cái)z入到細(xì)胞中。

2. 通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的酯水解酶去除乙酰氧基甲酯，轉(zhuǎn)換成游離脂肪酸的形態(tài)。

3. 通過(guò)脂酰CoA合成酶轉(zhuǎn)換成脂酰CoA，攝入β-氧化途徑。

4. 通過(guò)β-氧化循環(huán)壬酸（C9）按庚酸（C7）、戊酸（C5）、丙酸（C3）的順序轉(zhuǎn)換，在第四次β-氧化循環(huán)的丙酸

4. 被分解時(shí)，xiangdousu衍生物被釋放出來(lái)。xiangdousu衍生物在405 nm激發(fā)下發(fā)出藍(lán)色熒光。

5. 由于游離的xiangdousu衍生物擴(kuò)散到整個(gè)細(xì)胞中，因此通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的藍(lán)色熒光強(qiáng)度，可以實(shí)時(shí)且定量的評(píng)價(jià)β-氧

4. 化活性。

※　通過(guò)添加肉堿穿梭抑制劑的Etomoxir，有效地抑制了細(xì)胞內(nèi)的熒光上升。

※　該結(jié)果證明FAOBlue主要檢測(cè)線粒體的FAO活性。

◆特點(diǎn)

●　FAOBlue處于消光狀態(tài)，分解后的游離xiangdousu衍生物呈現(xiàn)出比分解前更高的熒光強(qiáng)度。

●　添加培養(yǎng)基后，30 min~120 min后便可觀察。

●　無(wú)需特別操作即可檢測(cè)β-氧化活性。

●　實(shí)例驗(yàn)證能觀察多種細(xì)胞類型的β-氧化。

●　有抑制藥物依賴性β-氧化和因促進(jìn)而引起的活性變化的成功檢測(cè)案例。

●　檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)405 nm/熒光460 nm。

※　注意：

使用共聚焦激光顯微鏡時(shí)，推薦使用405 nm激光激發(fā)。如果本試劑在330～380 nm的范圍內(nèi)激發(fā)的話，會(huì)觀察到無(wú)關(guān)FAO活性的370～450 nm（最大熒光波長(zhǎng)410 nm）的熒光。使用熒光顯微鏡時(shí)，為了特異性觀察FAO活性，推薦選擇激發(fā)波長(zhǎng)在390～430 nm范圍內(nèi)的激發(fā)光濾光片。詳情請(qǐng)參考數(shù)據(jù)實(shí)例：FAO特異性吸收光譜、熒光光譜的變化。

◆原著論文

Uchinomiya et. al., Chem. Commun. 56, 3023～3026 (2020) .

"Fluorescence Detection of Metabolic Activity of Fatty Acid Beta Oxidation Pathway in Living Cells."

◆應(yīng)用

●　評(píng)價(jià)各種細(xì)胞的β-氧化活性

●　β-氧化相關(guān)的基因基礎(chǔ)研究

●　抑制或促進(jìn)β-氧化的化合物的探索  等

◆操作方法概況

1. 在HBS中溶解FAOBlue至終濃度為5~20 μM^*1。

1. *1  針對(duì)不同的細(xì)胞類型，合適的濃度有所差異。建議根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討。

2. 去除培養(yǎng)基，用HBS清洗細(xì)胞2次。

3. 向細(xì)胞添加含有FAOBlue的HBS。

4. 在37°C下培養(yǎng)30 min以上^*2。

1. *2  針對(duì)不同的細(xì)胞類型，合適的培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)有所差異。建議根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討。

5. 更換培養(yǎng)基后^*3，通過(guò)成像觀察藍(lán)色熒光（Ex. 405 nm/Em. 430～480 nm）。

1. *3  染色后的培養(yǎng)基更換是非必須的。即使不清洗也可進(jìn)行觀察。

實(shí)驗(yàn)注意點(diǎn)

由于本試劑使用405 nm的激發(fā)光，根據(jù)不同的觀察對(duì)象，可能會(huì)觀察到其自發(fā)的熒光。建議同時(shí)進(jìn)行未添加本試劑的陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。尤其是在顯微鏡下觀察到點(diǎn)狀熒光信號(hào)時(shí)，可能就是細(xì)胞的自發(fā)熒光。

◆應(yīng)用實(shí)例

FAO特異性吸收光譜、熒光光譜的變化

FAOBlue以及xiangdousu衍生物的吸收光譜（左）和熒光光譜（右）。

FAOBlue在通過(guò)FAO轉(zhuǎn)換成xiangdousu衍生物后，吸收最大值由350 nm變?yōu)?05 nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)。因此，在405 nm的激發(fā)條件下，F(xiàn)AOBlue不會(huì)發(fā)出熒光，只有在通過(guò)FAO釋放xiangdousu衍生物時(shí)才會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光。

※　注意：

若使用處于FAOBlue的吸收最大值350 nm左右的光激發(fā)，F(xiàn)AOBlue也會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光（380～450 nm；最大波長(zhǎng)400 nm）。若在熒光顯微鏡中使用普通的DAPI濾光片，將會(huì)同時(shí)激發(fā)未反應(yīng)的FAOBlue以及FAO反應(yīng)后的xiangdousu衍生物。所以在選擇濾光片時(shí)請(qǐng)格外注意。

可視化各種細(xì)胞類型中的FAO活性

在4種癌細(xì)胞中加入FAOBlue，培養(yǎng)一定時(shí)間后進(jìn)行熒光觀察。所有細(xì)胞都觀察到了藍(lán)色熒光，而添加FAO抑制劑etomoxir后熒光顯著衰減，由此可知，藍(lán)色熒光是由FAO活性引起的。

※ 各種細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)條件有所不同。

※ HepG2 : 5 μM, 30 min

※ LNCaP: 20 μM, 120 min

※ HeLa : 20 μM, 120 min

※ A549 : 5 μM, 30 min

觀察刺激依賴性β-氧化的變化

向HepG2細(xì)胞添加脂質(zhì)代謝促進(jìn)劑AICAR^*2（200 μM，3 h）或部分FAO抑制劑ranolazine（200 μM，12 h）進(jìn)行前處理后，添加FAOBlue（5 μM）培養(yǎng)30 min。進(jìn)行熒光觀察時(shí)，可以看到對(duì)比對(duì)照實(shí)驗(yàn)（未處理），AICAR中熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，ranolazine中熒光強(qiáng)度明顯降低。

＊2  AICAR : AMPK（AMP-activated protein kinase）活化劑具有活化脂質(zhì)代謝的功能。

藥物作用的定量分析

使用FAOBlue可以定量分析藥物對(duì)FAO的效果。用非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）的候選治療藥ND-630（acetyl-CoA carboxylase inhibitor）前處理HepG2細(xì)胞4 h后，添加FAOBlue（5 μM）培養(yǎng)30 min。使用共聚焦激光顯微鏡評(píng)價(jià)藍(lán)色熒光強(qiáng)度時(shí)，可以觀察到依賴于ND-630濃度的熒光強(qiáng)度增加。由此可知，ND-630增強(qiáng)了FAO的活性。

NASH模型小鼠分析

非酒精性肝炎（NASH）是一種與脂質(zhì)相關(guān)的疾病，已知會(huì)降低脂肪分解的速度。向正常小鼠和NASH模型小鼠以口服形式給藥增強(qiáng)脂質(zhì)代謝的bezafibrate后，回收其肝臟制備初代培養(yǎng)肝細(xì)胞。向各個(gè)細(xì)胞加入FAOBlue（5 μM）觀察其FAO活性，結(jié)果顯示，對(duì)比正常小鼠來(lái)源細(xì)胞，NASH模型小鼠來(lái)源細(xì)胞的FAO活性明顯被抑制。另一方面，我們可以看到給藥bezafibrate的NASH模型小鼠來(lái)源細(xì)胞中FAO恢復(fù)了活性。

本試劑可用于脂質(zhì)相關(guān)疾病模型中的FAO定量分析。

※ 本頁(yè)面產(chǎn)品僅供研究用，研究以外不可使用。